[讨论] 母种细菌污染的原因

平菇叶

QUOTE:

以下是引用jph6060在2010-4-25 15:44:03的发言：
1试管在高压灭菌时, 试管内部空间没有真正进入饱和蒸汽状态, 造成局部假压, 在后来的冷却当中, 空间湿热水汽在管壁形成冷凝水, 造成冷凝水含有细菌.......

2棉塞较干, 在高压灭菌时, 是否也能同样达到灭菌彻底?   

1部分，高压灭菌放气时，试管内的液体在沸腾，停止加热的时候，什么时候放气它什么时候沸腾，大于100度的试管壁和固容物就是热源。棉塞挡不住沸腾而出的蒸汽，这就是棉塞被冲开，袋子被蒸爆的部分原因，何况频繁多次的放气。这里更显多次放气的重要。
2部分，较干的棉塞不能达到基质的灭菌效果，培养中继续保证棉塞较干的状态情况就有所改观，横放，避免抖动，减少冷凝水，严格无菌操作.............只为一个目的。

jph6060

试管在高压灭菌时, 试管内部空间没有真正进入饱和蒸汽状态, 造成局部假压, 在后来的冷却当中, 空间湿热水汽在管壁形成冷凝水, 造成冷凝水含有细菌.......

棉塞较干, 在高压灭菌时, 是否也能同样达到灭菌彻底?   

钟宪海

用起来却很多问题?有时我们的眼睛也会犯错!!!!!!!!!!

钟宪海

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

发酵罐

QUOTE:

以下是引用田鸿在2010-4-24 23:08:57的发言：

不清楚罐兄所指的“棉塞是一个时代的错误”。棉塞透气性好，加纱布包裹的固型棉塞用于母种生产反复使用很好，但不能用于冰箱保种，因为棉塞易湿，易致菌种污染，同时也易致斜面脱水，菌种老化快。化纤棉的塞子不能反复使用，基本每次都要做。硅胶塞透气性一般，用于生产母种制作满管时间长，用于冰箱保种不污染，斜面也不容易脱水，菌种不易老化，所以，建议生产母种制作用棉塞，而保种用硅胶塞。

可能我对棉塞有种歧视，只因我曾深受其害，所以认为传统上的无菌要求只是在超级搞笑，也有人搞“脱毒菌种”，我觉得他的幽默感更强一些，因我高价邮来的“脱毒菌种”竟用掉渣渣的短绒棉花。只因经历决定认识，棉塞经过储存，也许会在棉塞尖部出现霉点，那我们没有发现霉点的棉塞会不会是霉点的前天？我对即做即用的棉塞母种同样恐惧，那块肉眼看不见细菌的棉花与我的培养基实在相隔太近啊。田兄思想正统，但要理解我极左的思想，自古以来用棉塞一样成功，但现在的使用目的不同弊端就很快出现。

蕈苑

回南湖春老师：
  母种试管的细菌感染，可从以下几点查找原因：
  一、首先从接种块开始出现细菌群落，然后在培养基其它部位没有出现细菌群落，说明是接种块或接种工具带杂。
  二、接种后就从培养基开始出现细菌群落，则是因为试管或接种环境灭菌不彻底。

  我提倡接种时试管口略上扬，让冷凝水不接触种块的目的是避免冷凝水浸泡种块、造成种块死亡，从而保证种块的萌发及成活率。

  并且我还认为，试管中有冷凝水，在母种的培养过程中，可保证试管种中的空气湿度，更有利于菌丝的生长旺盛，同时也有利于保持菌种的活性。

  所以我认为，在制作母种时，只要能在做好试管的灭菌与接种的无菌操作的同时，不让冷凝水把菌种浸死，就不要担心试管中冷凝水的产生。

田鸿

与王老师探讨：（1）细菌有非培养和可培养两种类型，能在马铃薯培养基上生长的细菌都是可培养细菌，这些细菌不会以菌丝代谢物为营养而黏糊在菌丝上生长，这些可培养细菌污染斜面消耗培养基养分，产生对食用菌菌丝有害的毒素会所使菌丝长势极差，不会浓白，所以，菌丝上黏糊的细菌“隐形污染”可能性不存在，只有那些可能黏糊在菌丝上的非培养细菌才可能使菌丝处于“隐形污染”的状况，这也可能是食用菌菌种退化的原因之一，要观察菌丝上是不是有这种“隐形污染”的细菌细胞，只有用电镜才看得了，我没做过，只是推测。（2）在培养基严格灭菌和严格无菌接种操作前提下接种块出现细菌菌落，那肯定是种源带菌，种源带菌而没发现有两种可能，外引的劣质菌种和保存菌种的条件不好，冰箱使用不当，棉塞受潮甚至菌种试管中出现冷凝水，试管外的细菌顺水过棉塞到母种管中造成再转接时斜面出现细菌污染；（3）棉塞灭菌时可能因为棉塞使用太久，老化变硬，在多次分装试管时棉塞黏糊培养基但没处理造成杂菌在棉塞上生长，在灭菌时蒸汽可能没穿透在母种斜面上出现杂菌污染，不过，这种情况很少见到是细菌污染，更多是是霉菌污染。但有时候，有冷凝水的斜面接种后放置试管时冷凝水打湿是试管口的棉塞，黏糊了培养基的棉塞上细菌繁殖起来，检查试管时，细菌细胞顺水流入斜面，母种培养中就会出现细菌菌落。

lilin

     

斜面有冷凝水与细菌污染无关。但与菌丝生长的速度快慢有关。斜面污染细菌多为接种操作时空气中的细菌进入或接种钩接触有菌物体导致，或棉塞带菌。如果试管是灭菌彻底的，那细菌细胞肯定是从外界来的！

南湖春

     首先感谢蕈苑、福建老菇农、myb、田鸿等老师参与讨论，同时声明我在首帖中只是报告了一种现象：有冷凝水容易出现细菌污染。因为知道了这种现象，所以我在做母种培养基是的做法是灭菌结束后压力自然回复到零后打开锅盖，错开锅盖烘干棉塞，再降温至60度左右时取出摆放斜面，并覆盖棉布缓慢降温，尽量减少冷凝水产生，并放置一段时间待冷凝水蒸发后再接种，没再出现细菌污染。
    从跟帖中也可以看出，一种倾向是有冷凝水时菌块周围会出现细菌污染；另一种倾向是有冷凝水与种块周围没关系，是操作不当引起的。
    其中还有几点不明请各位老师指教：
    1.种块周围出现细菌污染是无菌操作不严造成的。如果是无菌操作不严，细菌在接种时进入试管，为什么仅在接种快周围出现细菌菌落，而种块外的培养基表面不出现细菌？（声明接种钩经严格灼烧灭菌）如果同样接种时，由于操作不严细菌也会进入没冷凝水的试管中，由于细菌比菌丝生长快的多，即使在没冷凝水的斜面上也会很快长出菌落，而实际上并没有细菌菌落。如果说冷凝水促进了细菌繁殖，而没有冷凝水时细菌不活跃，没表现出来，是不是可以说没冷凝水的斜面菌种就存在隐性污染？
    2. 种源是否有隐性污染。由第一问题引申出第二个问题，有人认为可能是种源有隐性污染。而实际上如田鸿老师所言，有点经验的都很容易判别细菌污染，不会再用细菌污染了的母种做种源。而且被细菌污染的斜面上，即使食用菌菌丝生长，也是长不好的，由此推断菌丝洁白粗壮浓密的种源应不存在隐性污染。而按照常识我们不会用菌丝生长非常差的母种做种源，这样出现接种块周围的细菌应该不是种块带来的。
    我认为隐性污染不能简单地解释为菌丝将细菌覆盖，而一种隐性污染有可能是在生长健壮的菌丝表面附着有少量细菌，而对菌丝的生长势没有太大的影响，而当将这种种块接种到有冷凝水的斜面上时，由于水分的存在促进了细菌的快速繁殖而表现为细菌污染？当然这只是一种推测。
   3.有人认为母种培养应避开冷凝水，我也认为此法可行。如蕈苑老师接种时把管口扬起或竖立培养避开冷凝水。如果冷凝水存在没关系，为何要避开呢？
   4.棉塞在湿热灭菌时是否得到彻底灭菌？湿润状态下的菌体蛋白在高温下易凝固，而在干燥状态下不易凝固，也就是说如果棉塞干燥时，其中隐藏的杂菌不易被杀死。而湿热灭菌过程中棉塞处于湿润还是干燥状态？我认为顶多是潮湿状态而非湿润状态，有可能杂菌没被完全杀死。发酵罐老师避开价廉的棉塞不用而用块把钱一个的硅胶塞就是一个例证。
   所以，无菌操作不严或种块隐性污染无论对有无冷凝水的斜面都会引起污染，将无菌操作不严或种块隐性污染做为有冷凝水时母种易污染的主要原因还值得商榷。
  

田鸿

好，越来越精彩了，晚辈学习中！！