[讨论] 母种细菌污染的原因

lsy6560483

接种时不要顾虑冷凝水的存在，细菌污染与它无关。

lsy6560483

我接菌都是在斜面定型后马上接菌，壁上和培养基表面的冷凝水很厚，但很少污染。

打包者

QUOTE:

棉塞做封口材料，按照下述方法来做，可减少冷凝水，也会降低棉塞污染的风险：
      1.灭菌结束后，自然降温至压力回复到零；
      2.打开锅盖，错开锅盖留10几厘米一条缝，利用锅体余热烘干棉塞；
      3.培养及温度降至60来度取出摆放斜面，斜面长度小于试管总长的2/3，覆盖棉布保温冷却；
      4.可能还会有少量冷凝水，在干燥处放置几天，冷凝水消失后再使用

补充一点，母种棉花塞一次性的，不重复利用。母种有细菌除了高压灭菌和操作有关系外，还可能跟酒精棉的浓度低也有很大的关系，酒精棉擦拭试管，过火却不着，不但没有起到消毒的作用，反而使杂菌带入试管内。

lineeq

“我要注册”兄弟 ，你有冷凝水的PDA空管培养一星期不见有污染。我想问问你的培养温度是多少？你有做过在35度的条件下培养试验的吗？说实的我做过好几次在35度条件下培养15天的试验，可以说基本上都有发现细菌菌落的，因此我现在基本不用有冷凝水的PDA，不知你用了又是如何。不过我希望你在没有很有把握的情况下还是尽量少用有冷凝水的培养基，总之我觉得这里面应该有一些让人不放心的问题，只是我们不知而已。我相信有很多人也会遇到这个问题或许勿视这个问题，也或许在很多学者，菇友的目中这个根本就不是问题。不过我不记得是在哪个贴里看过好像“脱毒灵”前辈也遇过这样的问题，现在楼主又提出这个问题，所以我觉得应该还有很多人也会遇到这个问题。所以也真的希望论坛里一些有丰富经验与高深的理论的网友，专家学者们能说说这个问题，相信对很多人有一定的帮助。在下先行谢过！

发酵罐

QUOTE:

以下是引用南湖春在2010-4-25 21:22:35的发言：

      斜面表面有冷凝水存在时，常常表现出细菌污染，这是不争的事实，有兴趣的话大家可以试验一下。有可能是细菌好水性强，原来的菌种本身就含有细菌，只是在无冷凝水的培养基上没有表现出来，而在无冷凝水的培养基上未表现出来。但肯定和无菌操作无关，同样的操作就表现出来这种差异。
      干燥的棉塞在灭菌时是否达到无菌的程度，没人做过实验，按灭菌原理应该是没有完全灭菌，但如此就将棉塞一棍子打死我觉得并不可取。比较价格昂贵的硅胶塞，棉塞价格低廉，只要操作的得当，是很好的封口材料。硅胶塞透气性差，如果不注意，冷凝水会更多，我用了几次就不再买硅胶塞了。
      棉塞做封口材料，按照下述方法来做，可减少冷凝水，也会降低棉塞污染的风险：
      1.灭菌结束后，自然降温至压力回复到零；
      2.打开锅盖，错开锅盖留10几厘米一条缝，利用锅体余热烘干棉塞；
      3.培养及温度降至60来度取出摆放斜面，斜面长度小于试管总长的2/3，覆盖棉布保温冷却；
      4.可能还会有少量冷凝水，在干燥处放置几天，冷凝水消失后再使用。

学生认为，冷凝水只是适合孢子的萌发，有水和无水的“污染率”其实是一致的。菌种带菌的几率较小，因从平面菌落的分布状态可以断定。但认识与您相反，恰恰与无菌操作有关，只是这个“无菌操作”需要打上引号，这是在意识形态以外的，我们有责任打造无菌的空间，但恰恰是在棉塞拔出管口的一霎那污染就发生了，空气倒流，细菌进入，有时我会看到灯火钻入试管引燃棉塞的飞沫，棉塞的三四十分钟的灭菌难道需要猜测？何况还有二次，假如这是猜测，我们的原种又何必熬到3个时辰？我们都已经做过试验了，污染就是试验。
硅胶塞的污染现象为零，我已经过长时间的验证。

南湖春

QUOTE:

以下是引用钟宪海在2010-4-25 21:57:58的发言：

菌种本身就含有细菌!细菌什么时侯进去的<谁是罪魁祸首>?我们难道又要推翻传统的无菌操作理论??????????????????????

不是啥时间进去的，二是用来接种的母种带有细菌，在培养真菌时真菌占优势，而细菌未表现出来。因为我们培养真菌时温度一般在25度，而且培养基相对干燥。当存在冷凝水或温度偏高时，隐藏的细菌就表现出来了。
母种带细菌只是一种推测，也需要更深层次的原因，所以才提出这样一个问题，请坛友讨论。

发酵罐

QUOTE:

以下是引用田鸿在2010-4-25 21:32:23的发言：
王老师可能买到劣质硅胶塞了。硅胶塞也不贵，一个菇场需要的母种不多，一次栽培，100只母种就够多了，100只母种用硅胶塞只要几十块钱，成本也不高，当然生产用母种还是用棉塞好些，透气性好，菌丝长势强，满管时间短，但用于保种，棉塞就不行了。冷凝水不是导致斜面长细菌的因素，是灭菌操作不正确和接种不当引起，与用什么塞子无关。

培养最好用带陶瓷（类似）通气塞的硅胶塞，不过只适合20mm试管。价格有点忘，可能2.5元左右。

发酵罐

QUOTE:

以下是引用钟宪海在2010-4-25 13:45:22的发言：
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
此主题相关图片如下专用母种.jpg：

液体绝不可用棉塞，这是您不明污染的首要原因。

南湖春

QUOTE:

以下是引用发酵罐在2010-4-25 22:59:32的发言：

学生认为，冷凝水只是适合孢子的萌发，有水和无水的“污染率”其实是一致的。菌种带菌的几率较小，因从平面菌落的分布状态可以断定。但认识与您相反，恰恰与无菌操作有关，只是这个“无菌操作”需要打上引号，这是在意识形态以外的，我们有责任打造无菌的空间，但恰恰是在棉塞拔出管口的一霎那污染就发生了，空气倒流，细菌进入，有时我会看到灯火钻入试管引燃棉塞的飞沫，棉塞的三四十分钟的灭菌难道需要猜测？假如这是猜测，我们的原种又何必熬到3个时辰？我们都已经做过试验了，污染就是试验。
硅胶塞的污染现象为零，我已经过长时间的验证。

1.孢子是谁的孢子？细菌还产生孢子？
2.外观看似无细菌污染的母种其实可能隐藏着细菌。组织分离后获得的F0代母种为何不能直接接原种？
3.棉塞透气，内外气压平衡，何来倒流？反倒是硅胶塞透气差，可能会出现倒流。300多多度的火焰封着试管口，细菌耐热胜过孙悟空？超净台、接种箱合格的话，管口哪来那么多细菌？
4.要表达的是棉塞无菌还是有菌？
5.原种高压2小时足矣，何必熬3个时辰？常压3个时辰不足；

平菇叶

精彩 思想火花的碰撞。
恰好我们生存在一个微生物无处不在的环境，在这个环境中缺少微生物作用难以想象。在这个环境中，棉塞担当了过重的责任，那是一个物质的屏障。其实我们心目中理想的屏障，那条无菌有菌的界限真的明朗么？