[讨论] 母种细菌污染的原因

shijian

   王老师的帖子启迪人们深思，通览一遍还没有让人信服的理由，我觉得用反推法、排除法设定条件，看能有多少种组合，一一否定之后结论会逐步明朗。

田鸿

请问王老师，宾州大学15分钟能灭菌彻底吗？为什么？

南湖春

QUOTE:

以下是引用田鸿在2010-4-26 0:23:50的发言：

如果担心棉塞灭不彻底，就将棉塞泡水，高压灭菌，再用70度的烘箱烘干再用就好了。再有，灭菌锅要使用时要放冷气的，在灭菌正常温度和灭菌时间内，不会灭菌不彻底。宾州大学他们121度的灭菌时间才20分钟。

田老师：宾州大学的母种培养基灭菌时间是15分钟，不过封口不是棉塞。


可查看此网站http://mushroomspawn.cas.psu.edu/Care-Handling.shtml

lineeq

试管在高压灭菌时, 试管内部空间没有真正进入饱和蒸汽状态, 造成局部假压, 在后来的冷却当中, 空间湿热水汽在管壁形成冷凝水, 造成冷凝水含有细菌....... 棉塞较干, 在高压灭菌时, 是否也能同样达到灭菌彻底?

............说真的我也有这样的看法，因为我也经常遇到有冷疑水时PDA会细菌污染的现象，而没有冷疑水时就比较少可以说是很少，我有时也想不通，因此只能小心地看着菌丝的生长性况来留取，而当我为了想弄清其中原因在同等条件下（同样的品种，同样的操作，同样的培养条件。。）做了很多这样的实验时，而有冷凝水的感染细菌的明显的多，因此也只有一个能让自己信服的说法就是培养基的问题，而究竟是培养基本身灭菌不彻底还是它已经是灭菌彻底了而又受到外界的污染了呢？按现在的理论PDA培养基是属于湿热灭菌，那么120多度这几十分钟应是可以，那么也只有一个说法就是受外界污染。但究竟是开盖太早造成温差太大（这也是产生冷凝水的主要原因）管内负压外界空气倒流而造成的还是本身试管内部就存在灭菌不彻底造成的？我还不知道，但“试管在高压灭菌时, 试管内部空间没有真正进入饱和蒸汽状态, 造成局部假压,”与“棉塞较干, 在高压灭菌时, 是否也能同样达到灭菌彻底? ”是怎样我不知道，但假如是会造成 “局部假压 ”与“干热灭菌 ”的话这个操作与现在的理论是不能相符的，这也或许能说明为什么会造成污染的其中一个原因。。。。这只是我个人的看法，望大家探讨与指正。

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话题挺深层的，我以前做pda时，试管里经常都会有冷凝水，试管冷却后就立放，空白培养一星期都不会有细菌，而接种后带冷凝水的试管就很容易有细菌菌落了

我要注册

我想那细菌是非常喜欢有水的地方的，在没有游离水的培养基上，细菌长势弱，没能形成菌落，所以就看不到，相对干燥的培养基上，细菌不能向鱼儿一样在水中游，长的弱，或许就消失在萌芽中了。

以上个人认识，纯属娱乐，大家拍砖！！！！！！！！！！！！！！！！

南湖春

      斜面表面有冷凝水存在时，常常表现出细菌污染，这是不争的事实，有兴趣的话大家可以试验一下。有可能是细菌好水性强，原来的菌种本身就含有细菌，只是在无冷凝水的培养基上没有表现出来，而在无冷凝水的培养基上未表现出来。但肯定和无菌操作无关，同样的操作就表现出来这种差异。
      干燥的棉塞在灭菌时是否达到无菌的程度，没人做过实验，按灭菌原理应该是没有完全灭菌，但如此就将棉塞一棍子打死我觉得并不可取。比较价格昂贵的硅胶塞，棉塞价格低廉，只要操作的得当，是很好的封口材料。硅胶塞透气性差，如果不注意，冷凝水会更多，我用了几次就不再买硅胶塞了。
      棉塞做封口材料，按照下述方法来做，可减少冷凝水，也会降低棉塞污染的风险：
      1.灭菌结束后，自然降温至压力回复到零；
      2.打开锅盖，错开锅盖留10几厘米一条缝，利用锅体余热烘干棉塞；
      3.培养及温度降至60来度取出摆放斜面，斜面长度小于试管总长的2/3，覆盖棉布保温冷却；
      4.可能还会有少量冷凝水，在干燥处放置几天，冷凝水消失后再使用。

钟宪海

QUOTE:

以下是引用南湖春在2010-4-25 21:22:35的发言：

      斜面表面有冷凝水存在时，常常表现出细菌污染，这是不争的事实，有兴趣的话大家可以试验一下。有可能是细菌好水性强，原来的菌种本身就含有细菌，只是在无冷凝水的培养基上没有表现出来，而在无冷凝水的培养基上未表现出来。但肯定和无菌操作无关，同样的操作就表现出来这种差异。
      干燥的棉塞在灭菌时是否达到无菌的程度，没人做过实验，按灭菌原理应该是没有完全灭菌，但如此就将棉塞一棍子打死我觉得并不可取。比较价格昂贵的硅胶塞，棉塞价格低廉，只要操作的得当，是很好的封口材料。硅胶塞透气性差，如果不注意，冷凝水会更多，我用了几次就不再买硅胶塞了。
      棉塞做封口材料，按照下述方法来做，可减少冷凝水，也会降低棉塞污染的风险：
      1.灭菌结束后，自然降温至压力回复到零；
      2.打开锅盖，错开锅盖留10几厘米一条缝，利用锅体余热烘干棉塞；
      3.培养及温度降至60来度取出摆放斜面，斜面长度小于试管总长的2/3，覆盖棉布保温冷却；
      4.可能还会有少量冷凝水，在干燥处放置几天，冷凝水消失后再使用。

菌种本身就含有细菌!细菌什么时侯进去的<谁是罪魁祸首>?我们难道又要推翻传统的无菌操作理论??????????????????????

田鸿

王老师可能买到劣质硅胶塞了。硅胶塞也不贵，一个菇场需要的母种不多，一次栽培，100只母种就够多了，100只母种用硅胶塞只要几十块钱，成本也不高，当然生产用母种还是用棉塞好些，透气性好，菌丝长势强，满管时间短，但用于保种，棉塞就不行了。冷凝水不是导致斜面长细菌的因素，是灭菌操作不正确和接种不当引起，与用什么塞子无关。

发酵罐

QUOTE:

以下是引用jph6060在2010-4-25 15:44:03的发言：
试管在高压灭菌时, 试管内部空间没有真正进入饱和蒸汽状态, 造成局部假压, 在后来的冷却当中, 空间湿热水汽在管壁形成冷凝水, 造成冷凝水含有细菌.......

棉塞较干, 在高压灭菌时, 是否也能同样达到灭菌彻底?   

“局部假压”的好像已成为一个专业词语，我觉得“局部假温”更贴切一些，在瓶口不是绝对密封的情况下，锅内任何角落的压强是一致的。个人认为高压锅的温度设定要以温度为指标而不是压力，这样可以减小因放气不尽造成的影响。个人认为，高压锅局部假温与放气过早时间过短有绝对的关系，假如放气完毕，被灭物品还没有升至100度以上，那瓶袋内的空气就没有完全溢出。