[推荐]微生物与发酵工艺知识大全

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2.促进扩散（facilitated diffusion）
　　一些极性分子的被动扩散过程同时都显示出饱和效应，以及与其结构类似物的竞争关
系。这说明这些极性分子的被动输送是在载体的帮助下进行的。因此可将促进扩散定义为有特异的载体蛋白参加而不需代谢能的输送机制。
　　假设膜上存在一种载体蛋白，它们的外部是疏水的，但在与被输送物质特异结合的部位却保持着较高的亲水性。载体上的亲水结合部位取代了极性溶质分子上的水合水层，从而实现了载体与溶质分子的接合。当具有疏水外表面的载体把溶质分子带入脂相并通过一定的易位机制到达膜的另一侧时，因为细胞内溶质浓度较外面低，溶质分子从载体上离解下来。由于上述“促进”作用，使其扩散速度比简单扩散快。
　　促进扩散不需消耗代谢能，但它对温度和pH敏感，这可能与膜的液晶状态以及存在于膜上的载体蛋白的生理活性有关，输送速度也受被输送物质的浓度（浓度梯度）的影响。
许多真核微生物都以促进扩散方式来输送糖分。但原核微生物很少采取这种输送方式，只有在突变或其它原因的影响下使其丧失主动吸收能力时，才用促进扩散方式送糖。

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１.主动输送 　　营养物质逆其自身的浓度梯度由稀处向浓处运动并在细胞内富集的过程称为主动输送或主动吸收。主动输送需要消耗能量，并且必须依赖载体。(图3-2) 　　载体与酶均为蛋白质，而且有些可以被诱导产生；它们均与底物（或被输送物）有特异的结合部位；与特定的底物（或被输送物）有一定的亲和力，而且结合时有一定的结合速度；它们与底物（或被输送物）的类似物有竞争作用；由几个亚基组成的，均有功能性亚基（催化功能或输送功能）和调节亚基；所参与的反应（或输送）速度受底物（或被输送物）的浓度、环境的pH和温度等影响。 　　载体与酶主要区别是载体并不发生催化作用，运输过程中不改变被输送物质的状态；而载体本身的状态却经常会有变化，如载体蛋白分子的吸能放能、磷酸化和脱磷酸，并由此发生构象变化等。

图3-2　主动输送模拟图

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1.简单主动输送（simple active transport）
　　在消耗代谢能的同时，实现溶质（营养物质）在细胞内的浓缩而没有任何化学变化发生的输送机制称为简单主动输送。
　　营养物质通过离子载体转运过膜可以有两种模式。一种是动态载体（mobile carrier）系
　　在消耗代谢能的同时，实现溶质（营养物质）在细胞内的浓缩而没有任何化学变化发生的输送机制称为简单主动输送。
　　营养物质通过离子载体转运过膜可以有两种模式。一种是动态载体（mobile carrier）系统，这种输送系统是通过改变与营养物结合的部位（或是旋转，或是穿梭）来输送营养物质的。另一种是静态载体（static carrier）系统，这种系统在膜上基本保持静止，并且有供溶质通过的亲水通道或孔，为跨膜输送提供方便。

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2．基团移位（group translocation） 　　基团移位是指被输送的基质分子在膜内经受了共价的改变，以被修饰的形式进入细胞质的输送机制。由于这种输送是在磷酸基团发生移位（即从磷酸烯醇式丙酮酸开始，最后转移到被输送基质分子上）的过程中实现的，故有“基团移位”之称。因为在输送过程中消耗了磷酸烯醇式丙酮酸上的高能磷酸键的键能，所以这种输送也属于主动输送。 　　基团移位不同于简单主动输送，因为它要借助于酶或定向酶系统进行输送，而且分别在膜两侧的基质与其衍生物在结构上也不同。 　　基质的主动输送问题还处于研讨之中，不同的微生物吸收不同的基质的方式可能有较大的差别。如需氧的假单孢杆菌以简单主动输送方式吸收糖，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和一些厌氧菌或兼性厌氧菌则以基团移位方式吸收糖。 有关四种营养物质输送方式的比较见表3-17。 表3-17　四种营养物质输送方式的比较

项目 被动扩散 主动输送 简单扩散 促进扩散 简单主动输送 基因移位 特异载体蛋白 输送速度 溶质输送方向 平衡时内外浓度 输送的分子 能量消耗 输送前后溶质分子 载体饱和效应 与溶质类似物 输送抑制物 输送对象举例 无 慢 由浓至稀(顺向) 内外相等 无特异性 不需要 不变 无 无竞争性 无 H2O、CO2、O2 甘油、乙醇、盐类、少数氨基酸 有 快 由浓至稀(顺向) 内外相等 特异性 不需要 不变 有 有竞争性 有 SO42-、PO43-、糖(真核微生物) 有 快 由稀至浓(逆向) 内部浓度高得多 特异性 需要 不变 有 有竞争性 有 氨基酸、乳糖等糖类、Na+、Ca2+等无机离子 有 快 由稀至浓(逆向) 内部浓度高得多 特异性 需要 改变 有 有竞争性 有 一些糖类、碱基、核苷、短链脂肪酸等

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四、微生物培养基
　　培养基(culture media)，是指由人工方法配合而成的，专供微生物培养、分离、鉴别、研究和保存用的混合营养物制品。用于微生物生长、繁殖和生产产物为目的的营养物质的综合体都是微生物的培养基。培养基应具有的共性为∶
　　1.单位数量的培养基应能以最高产率地生产出所需产物，如单细胞蛋白或目的代谢物；
　　2.能最高速率地稳定合成出所需产物；
　　3.培养基成分应价格便宜，易于就近取材；
　　4.培养基有利于通风、搅拌、提取、纯化和废物处理等。

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（一）培养基的要素
　　工业微生物研究和实验中的微生物培养基必须具备如下几个要素：
　　1.营养物质：包括研究或实验微生物所需要的碳、氮、磷、硫等宏量元素及微量元素、生长因素及水等。因此自养菌与异养菌的培养基的成分有显著的不同，前者不含有机化合物，后者需要有机化合物作为碳源和能源。在营养缺陷型（生长因素异养型）微生物的培养基中，必须配入所缺的生长因素。
　　2.水的活度：实际上是控制好培养基中可溶物质（特别是碳源）的浓度。
　　3.pH值：指灭菌后pH值，这与pH缓冲液和缓冲物（如CaCO3）的使用有关。
　　4.培养基的物理状态。
      5.灭菌方法。

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（二）培养基的类型
　　微生物培养基的种类很多，据不完全统计，常用的在1700种以上。而且，随着生物科学的飞速发展，培养基的种类亦将不断增加。一般常以培养基的形态、成分、用途和性质来区分。表3-18 概括了培养基的类型。
表3-18　培养基类型

分类特征	培养基名称
基质的来源	天然培养基、合成培养基、半合成培养基
物理状态	液体培养基、固体培养基、半固体培养基
目的用途	种子培养基、发酵培养基、菌种保藏培养基、富集培养基、选择性培养基、鉴别培养基和测定生理特性的培养基
调控育种	基本培养基、完全培养基、补充培养基

1按基质的来源
　　(1)天然培养基
　　天然培养基含有各种成分及其量不一定确切知道的天然物质，如蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏、玉米浆、麦芽浸膏等。用此类材料配成的培养基很难做到不同批号之间质量的稳定一致，因其随品种、产地、季节、加工条件等变化而有所波动。因此在选用原料时务必标明其商品的名称及批号，对不同来源的这些商品还应先作小试。虽然天然培养基存在这些缺点，但其成本较低，微生物生长较好，所以一般使用的培养基，均以天然培养基为主。
　　(2)合成培养基
　　合成培养基是由已知化学成分的营养物质组成的。由于微生物对营养要求的不同，它可以完全由无机盐或无机盐加有机化合物(氨基酸、糖、嘌呤、嘧啶、维生素等)组成。这种合成培养基的配方成分都是已知的，所以只要配制过程的操作严格要求，各批培养基的质量可做到稳定一致。
　　合成培养基的成本较高，其价格相当于同类天然培养基的几倍以至几十倍，因此，合成
培养基一般只能在研究工作中使用，如微生物碳源与氮源的同化和发酵等，微生物的遗传育种中营养缺陷型的检测和重组株的确定和菌种鉴定等。
　　(3)半合成培养基
　　由部分天然材料和部分化学药品组成的培养基称为半合成培养基。由于多数微生物均能在此类培养基上生长，加上配制方便，成本低，所以生产或实验经常用此类培养基。
实验室中常用的天然材料及其主要成分见表3-19，表3-20 。
表3-19　玉米浆的平均化学组成

项目	白玉米浆(%)	黄玉米浆(%)
蛋白质 氨基酸 还原糖 总磷 溶磷 酸度 SO2 乳酸 总灰分 铁 重金属	43.00 3.90 2.32 3.75 1.25 10.00 0.23 12.51 19.35 0.064 0.0082	41.90 4.02 1.90 3.62 1.52 10.90 0.20 12.09 21.02 0.050 0.0084

表3-20　一些天然材料的来源及其主要成分

材料名称	来源	主要成份	用量(%)
麦芽浸膏	大麦芽的水溶性浸出物经浓缩而成的黄色黏稠膏状物。	麦芽糖占总固形物一半以上。含有少量其他糖类，含有机氮化合物约占4-5%。还含有维生素和嘌呤、嘧啶等，营养完全。	一般视麦芽糖要求量。
蛋白胨	将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成的黄色粉末状物质。蛋白胨的成分组成随原料（动物原料或植物原料）和制法（酶解法或酸解法）不同而异，实验中不要轻易换用蛋白胨试剂。	主要供给有机氮化合物，同时也提供一些维生素和碳水化合物。	0.2-2.0
酵母膏 (酵母浸膏)	酵母细胞的水溶性自溶提取物经浓缩而成的黄褐色黏稠膏状物。	提供大量的B族维生素，大量氨基酸、嘌呤。	0.5-2.0
牛肉膏 (牛肉浸膏)	瘦牛肉组织浸出汁浓缩而成 的黄褐色黏稠膏状物。	碳水化合物（有机酸类），有机氮化合物（氨基酸、嘌呤、胍类、尿素等）、无机盐（钾、磷等）和水溶性维生素（主要是B族维生素）。	0.5-1.0
糖蜜	制糖过程中无法结晶的母液，色泽红褐色	含蔗糖、还原糖、生物素、无机盐、少量氨基酸和B族维生素。甘蔗糖蜜含还原糖、生物素较甜菜糖蜜多。	一般视糖量要求。

*浸膏也可采用将其浓缩物喷雾干燥而成浸粉

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2. 按物理状态
　　(1)液体培养基
　　用各种材料的抽提物或化学用品按一定量配成的水溶液或液体状态的培养基叫液体培养基，液体培养基常用于大量生产发酵产品和菌体。微生物在液体培养基中静止生长时，需氧微生物往往可在液面形成膜、岛、环，而液体仍清晰透明；厌氧或兼性厌氧微生物生长而导致液体混浊或有沉淀。
　　(2)固体培养基
　　除了用固体物料加水或营养盐构成的疏松固体培养基（用于固体发酵、如曲、固体酶制剂、酱）外，固体培养基主要是指在以上培养基中加入一定量能固化液体培养基的胶体物质，所配制成的固体胨状培养基。将微生物细胞接种到固体培养基上培养，它的所有后代都聚集在一起，形成一定状态的菌落或菌苔，并表现出其它特定的培养特征。固体培养基对于研究微生物的分离、纯化、培养、保存、鉴定等均是不可缺少的。制备固体培养基的胶体有琼脂、明胶和硅胶。
　　　　a.琼脂（agar）：它是由石花菜等红藻加工制成的一种胶体物质。主要由琼脂糖(agarose)和琼脂胶（agaropectin）两种多糖组成。除天蓝色链霉菌和某些海洋弧菌外，所有的微生物均不降解琼脂。琼脂不同于一般的固化剂，液态的琼脂培养基在45℃时固化，而固态的琼脂培养基在近100℃时才融化，它在45~100℃的温度范围内没有变化。配制固体培养基时琼脂的用量为：半固体培养基加0.5%，固体培养基加1.2-2.0%。
　　　　b.明胶（gelatin）：它是由动物的皮、骨、韧带、髓等和水一起煮熬而成的一种蛋白质，含有多种氨基酸，缺少色氨酸。用它制固体培养基对微生物有一定营养价值。液态的明胶培养基在24℃时凝固，固态的明胶培养基在28-35℃时融化。因此用明胶做固化剂的固体培养基一般只能在20-25℃以下使用，其用量为10-12%或更多。明胶培养基主要用于检测蛋白酶即明胶液化能力。
表3-21　系琼脂和明胶的比较。
表3-21　琼脂和明胶的特性比较

　　　　c.硅胶（silica gel）：在研究土壤微生物、自养微生物，或微生物对碳氮的利用时，常用硅胶做固体培养基的固化剂，因为硅胶全是无机物，适用于培养自养菌。用水玻璃（硅酸钠）与盐酸先制作好无菌凝胶，然后加入无菌营养液，可得到硅胶固化的固体培养基。
　　(3)半固体培养基
　　在配制固体培养基时，固化剂加得少些就可得到半固体培养基，如加琼脂0.2-0.5%所得半固体培养基可用来观察细菌的运动。

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3.按目的用途
　　(1)种子培养基
　　为了在较短的时间内获得数量较多的强壮而整齐的种子细胞，要采用种子培养基。种子培养基要求营养丰富、全面，氮源、维生素的比例应较高，碳源比例应较低。由于种子培养基用量少，对菌体生长要求高，故使用原料要求较高。
　　(2)发酵培养基
　　用来生产目的发酵产物的培养基，用量大。由于产物分子中往往以碳成分为主，所以发酵培养基中碳源含量往往高于种子培养基，若产物含氮量较高，氮源物质也要相应增加。由于碳源、氮源用量多，故要用价格较低的原料，尽量就近取材。
发酵培养基不仅要根据发酵工艺的要求配制，还要虑及后提取的方便。
　　(3)菌种保藏培养基
　　一般根据微生物的种类和营养要求加以选择，以细菌常用营养琼脂培养基；酵母菌常用麦汁琼脂培养基；霉菌常用察氏培养基；放线菌常用高氏一号培养基。
　　有些细菌在全糖的培养基中会因发酵产酸抑制细菌本身的生长，为避免酸度过高，可于培养基中加入2%CaCO3（分消后加入）。
　　氨基酸高产株的保藏培养基一定要营养丰富，尤其是所缺陷的营养物要充足；若为某氨基酸的结构类似物抗性突变株，则要在培养基中同时添加适量的该结构类似物，而培养基中该氨基酸的含量要尽量低。若高产株对某抗生素具有抗性，可以在保藏培养基中添加一定量的该抗生素。
　　(4)富集培养基(Enrichment media)和选择性培养基(Selective media)
　　这是为了分离某类微生物而加入助长该类微生物的营养物质或加入抑制其他微生物生长的抑菌剂而设计的培养基。在这类培养基中，某种微生物将比其他微生物生长繁殖更加快，能以明显的生长优势而抑制其他类群微生物的生长。因此利用这类培养基可以从杂居多种微生物的样品较容易地分离出目的微生物。但能在这种培养基上生长的微生物并不是一个纯种，而是营养要求或抗性类似的类群。所以这种富集和选择性只是相对的。
　　利用这类培养基分离或富集所需要的某种微生物时，能将培养基的营养成分和培养的环境条件，如通气、温度、渗透压、光等结合起来，分离效果更佳。化学抑制物质一般为染色剂、抗菌素、结构类似物、食盐等。
　　(5)鉴别培养基(Differential media)
　　鉴别培养基是指添加了某种或某些特定的化学药品，因而能对特定的微生物分类学上的种群起鉴别作用的培养基。如可以用伊红-甲基蓝培养基区分大肠杆菌和产气杆菌，在这个培养基上，大肠杆菌菌落小、兰紫黑色，且具有金属光泽；产气杆菌菌落大、湿润、灰棕色。用这种培养基，可根据平皿培养基上的特征性现象鉴别微生物，它比选择性培养基、富集培养基在选择性上能更专一区分不同微生物种群。
　　在培养基中加入某种抑制剂和指示剂，以抑制某些细菌生长，而促进某种病原菌的繁殖，并使菌落具有一定特征,以助鉴别分离。这类培养基称为选择性鉴别培养基（表3-22）。
表3-22　常见的一些鉴别培养基

　　(6)生理特性测定培养基
　　在鉴定微生物时，用于观察微生物的培养特征，或观测其生理生化反应所采用的培养基叫做测定生理特征的培养基。这些培养基都是规定了的，可以从有关的微生物学手册上查到。

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（三）实验培养基配制注意点
　　1.营养成分
　　(1)通常在培养基内加入KH2PO4、KH2PO4和MgSO4，以供应P、S、Mg、K，如果同时加入钙和铁，则上述三种盐的用量要适当加大，这主要是考虑到它们之间会形成不溶性的磷酸盐或氢氧化物，影响正常的使用。蛋白胨、酵母膏和其它生物制品都含有磷酸盐。若培养基中有Mg++、Ca++等离子，就会出现沉淀、浑浊。为避免生成沉淀，可将盐配成溶液，分开灭菌
后再加入培养基内。
　　(2)有些糖类或营养物质在高温、高压下会被破坏，故应降低压力、温度，或缩短时间，或用过滤或其它方法除菌（如化学灭菌法）。
　　(3)除培养固氮菌外，在培养基中均需加入无机氮和有机氮源。许多细菌不能利用硝酸盐，宜用铵盐作无机氮源；真菌大多可利用铵盐，也能利用硝酸盐。细菌虽能利用无机氮，但不如利用有机氮普遍，常用的有机氮源主要有蛋白胨、明胶、牛肉膏和酪蛋白水解液等。
　　(4) 营养物质的浓度，配制培养基时，营养物质的浓度应适当，太低不能满足生长需要，偏高会使菌体疯长，过高还会抑制微生物生长。所以配制培养基应按规定的浓度配制。
　　2.pH值
　　微生物要求培养基有适宜的pH值，但它们的代谢作用又会改变培养基的pH值，所以在配制培养基时，不仅培养基的起始pH值应符合微生物的要求，而且要考虑采用如何的缓冲作用保持其pH。一般在培养产酸的微生物时可在培养基中加入适量的CaCO3，以中和不断产生的酸。在合成培养基中，培养基成分中有磷酸盐者一般都已设计好pH值，故不需再专门调pH值。若pH值降到4.5以下，琼脂固体培养基灭菌后不再凝固，或凝固不坚，这时有关成分分别灭菌再予混合效果较好。
　　3.灭菌
　　灭菌时培养基颜色变褐（称为“焦化”或美拉德反应），主要原因是还原糖类、蛋白质与氨基酸在高压、高温下相互作用的结果。这种褐色物质会抑制微生物的生长，应尽量防止。缩短高温灭菌时间，或将糖与含氮化合物分开灭菌，可以防止这种反应。