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次级代谢产物高产菌株的筛选方法如下：
　　(a) 利用营养缺陷型筛选。抗生素产生菌的营养缺陷型大多为低产菌株，但是如果某些次级代谢和初级代谢处于同一分枝合成途径时，筛选初级代谢产物的营养缺陷型常可使相应的次级代谢产物增产。例如，芳香族氨基酸营养缺陷型可能增产氯霉素，芳香族氨基酸和氯霉素的生物合成途径中有一个共同的中间代谢物莽草酸，当诱变处理使莽草酸→芳香族氨基酸的生物合成出现遗传性阻碍时，菌体不能够合成芳香族氨基酸，从而避免了芳香族氨基酸对莽草酸生物合成的反馈调节，莽草酸得以大量合成，进而合成大量的氯霉素。同样的道理，脂肪酸和制霉菌素、四环素、灰黄霉素有共同的中间代谢物丙二酰CoA，脂肪酸营养缺陷型可以增产上述的抗生素。类似的例子还有头孢菌素产生菌的亮氨酸营养缺陷型可增产头孢菌素C，亮氨酸和缬氨酸有共同的中间代谢物α-酮基异戊酸，亮氨酸营养缺陷型使得缬氨酸的生成量增加，缬氨酸作为头孢菌素C合成的前体物质，参与头孢菌素C母核的合成，所以亮氨酸营养缺陷型可以提高头孢菌素C的发酵产量。一般来说，氨基酸营养缺陷不适合工业发酵生产的要求，将这种氨基酸营养缺陷型和生产菌株(或另一种营养缺陷型)杂交或者回复突变，可能得到适合于工业生产的高产菌株。因为这样的杂交后代或回复突变株，可能既保留了营养缺陷型的代谢优点(生成较多的抗生素前体)，又便于发酵生产的控制(不需要另外补充相应的营养物质)。而且，还可能通过杂交或回复突变获得具有和抗生素合成有关的基因的部分二倍体。
　　筛选渗漏缺陷型是一种值得重视的方法。所谓渗漏缺陷型(leaky mutant)是遗传性障碍不完全的营养缺陷型。突变使某一种酶的活性下降而不是完全丧失，所以这种缺陷型能够少量地合成某一代谢产物，能在基本培养基上少量地生长。由于渗漏缺陷型不会合成过多的终产物，所以不会造成反馈调节而影响中间代谢物的积累。大多数抗生素高产菌株的生长速率低于野生型菌株的生长速率，似乎可以认为它们在某种意义上属于渗漏缺陷型，生长速率降低可能有利于抗生素合成。一般文献中采用上标“-”表示营养缺陷型，上标“L”表示渗漏缺陷型，例如：Met-+ ThrL表示甲硫氨酸缺陷和苏氨酸渗漏。
　　根据以上的推理，可设计如下筛选过程：先进行摇瓶发酵试验，选出对抗生素发酵产量有明显影响的初级代谢产物，据此诱变出相应的营养缺陷型，然后再诱发回复突变或将野生型菌株诱变成另一营养缺陷型，再与之杂交。如欲筛选渗漏缺陷型，则把营养缺陷型接种在基本培养基上，这上面出现的菌落是回复突变株，其中长得特别小的菌落可能是渗漏缺陷型。
　　(b) 筛选负变株的回复突变株。选择经过诱变处理后抗生素生产能力明显降低或完全丧失，但其他性状仍近于正常的突变株作为实验材料，进行诱变，再挑选高产菌株。因为两次诱变都作用于和抗生素生物合成有关的基因上，动摇了抗生素合成的遗传基础。用此方法得到的突变株，其与抗生素合成有关的酶受调节的程度，往往低于原出发菌株。此外，从负变株中筛选回复突变株也比较容易，因为负变株没有发酵产量或发酵产量很低，便于从中检出有较高抗生素产量的回复突变株。
　　(c) 筛选去磷酸盐调节突变株。磷酸盐对许多抗生素的生物合成有抑制作用，筛选去磷酸盐调节突变株对于生产抗生素是很有意义的。因为要提高抗生素的产量，既要使生产菌生长到一定的量，又要使产生较多的抗生素。这样培养基中必须加入一定量的磷酸盐，以供菌体生长的需要，但菌体生长所需要的磷酸盐浓度往往对抗生素有抑制作用，去磷酸盐调节突变株可消除或减弱这种抑制作用以获得高产。

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筛选能在磷酸盐抑制浓度条件下，正常产生抗生素的突变株的过程：将孢子悬浮液诱变处理后，将孢子接种于完全培养基上，使突变株得以表达，再把完全培养基上的菌落影印接种于发酵培养基(含正常浓度的磷酸盐、加琼脂)，待菌落长出后，用打孔器把长有单个菌落的琼脂块转移到一张浸有高浓度磷酸盐的滤纸上培养、发酵，然后进行生物测定。抑菌活力(抑菌圈直径／菌落直径)明显大于其他菌落的可能就是去磷酸盐调节突变株，从影印平板挑取相应的菌落，摇瓶发酵测定抗生素产量。
　　筛选磷酸盐结构类似物(如砷酸盐、钒酸盐)抗性突变株的过程：磷酸盐结构类似物对菌体结构具有毒性，其抗性菌株可能对磷酸盐调节不敏感。例如，钒酸钠是一种ATP酶的抑制剂，粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)细胞内有两种磷酸盐转运系统：一是低亲和力的磷酸盐转运系统Ⅰ，一是高亲和力的磷酸盐转运系统Ⅱ。钒酸钠抗性突变株，缺失磷酸盐转运系统Ⅱ，因而避免了过多地吸收钒酸钠而导致菌的死亡，同时也避免了过多地吸收磷酸盐而导致磷酸盐抑制。

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(d) 筛选去碳源分解代谢调节突变株。能被菌快速利用的碳源在被快速分解利用时，往往对许多其他代谢途径中的酶(包括许多抗生素合成酶和其他的酶)有阻遏或抑制作用，成为抗生素发酵产量的限制因素，不利于发酵生产工艺的控制。筛选去碳源分解代谢调节突变株，对于提高抗生素发酵产量，简化发酵生产工艺具有重要意义。抗生素生产中最常见的碳源分解代谢调节是“葡萄糖效应”，葡萄糖被快速分解代谢所积累的分解代谢产物在抑制抗生素合成的同时也抑制其他某些碳、氮源的分解利用。因此，可以利用这些碳(或氮)源作为惟一可供菌利用的碳(或氮)源，进行抗葡萄糖分解代谢调节突变株的筛选。例如，将菌在含有葡萄糖(阻遏性碳源)和组氨酸为惟一氮源的培养基中连续传代后，可选出去葡萄糖分解代谢调节突变株。正常的组氨酸分解酶类是被葡萄糖分解代谢物阻遏的，如果突变株能在这种培养基中生长，说明它具有能分解组氨酸而获得氮源的酶。这样的结果，可有两种解释：一是组氨酸分解酶发生了突变，不再受到原有的分解代谢物阻遏；二是葡萄糖分解代谢有关的酶发生了突变，不再产生或积累那么多的分解代谢阻遏物。第二种解释符合许多去葡萄糖分解代谢调节突变株的特性，因为同时有许多酶(受分解代谢调节的酶)的生成都不再受到葡萄糖分解代谢物阻遏。这种现象也是在抗生素育种工作中选择这种方法筛选去碳源分解代谢调节突变株的依据。
　　葡萄糖的（毒性）结构类似物也可用于筛选去碳源分解代谢调节突变株。例如，以半乳糖作为可供菌生长利用的惟一碳源，再于培养基中添加葡萄糖的结构类似物，该结构类似物不能为菌所利用，但可抑制菌利用半乳糖。所以，在这种培养条件下，只有去葡萄糖分解代谢调节突变株能够利用半乳糖进行生长，原始菌株由于不能利用半乳糖而不能生长。因而可选出去碳源分解代谢调节突变株。筛选去碳源分解代谢调节突变株还应注意避免走向另一个极端，即片面追求葡萄糖分解代谢速率下降，因为保持合适的葡萄糖分解代谢速率是抗生素高产的关键。

图4-7　葡萄糖的（毒性）结构类似物
　　此外，筛选淀粉酶活性高的突变株，以利于在发酵培养基中增加淀粉类物质作为补充碳源，也可以减弱碳分解代谢调节对抗生素生产的抑制作用。

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(e) 筛选氨基酸结构类似物抗性突变株。许多抗生素和氨基酸有共同的前体或者有些氨基酸本身可以作为某些抗生素的前体。因此，氨基酸的代谢和抗生素合成有着密切的联系，打破菌的氨基酸代谢的调节，可能导致抗生素高产。
　　在培养基中加入氨基酸结构类似物，氨基酸结构类似物对菌的生长有抑制作用，因此可以筛选到解除了氨基酸反馈调节的突变株。这些突变株能够在含有氨基酸结构类似物的培养基中生长，抗性的机制可能在于生成较多的氨基酸，从而提高抗生素前体的量。例如，在青霉素生物合成途径中，半胱氨酸和缬氨酸是青霉素母核的前体，筛选抗半胱氨酸结构类似物或抗缬氨酸结构类似物的抗性突变株，可能提高半胱氨酸或缬氨酸的生成量，进而提高青霉素产量。又如赖氨酸和青霉素有共同的中间代谢产物α-氨基己二酸，筛选赖氨酸结构类似物抗性突变株，可以解除赖氨酸对α-氨基己二酸生成的反馈调节，使α-氨基己二酸生成量增加而促进青霉素合成。
　　筛选氨基酸结构类似物抗性突变株的方法：将菌种诱变处理，接种于含抑制浓度的氨基酸结构类似物的培养基中，由于此种培养条件使得正常菌株不能生长，而抗氨基酸反馈调节的突变株或其他抗性突变株能够生长，因此可筛选出氨基酸结构类似物抗性突变株。在实际操作过程中，有许多氨基酸结构类似物并不抑制菌的生长，或只有在高浓度时才抑制菌的生长。因此要选择合适的氨基酸结构类似物用于筛选。还有一些氨基酸结构类似物仅抑制菌落的生长和减少孢子的数量，且高浓度都不抑制菌落形成和孢子形成，在此情况下，正常大小或正常产孢子的菌落被视为抗性菌。还可以用加入抗代谢抑制剂(如多烯类抗生素)方法，使细胞膜透性增加而提高筛选效果。

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(f) 筛选二价金属离子抗性突变株。加入能和产物(抗生素)或其中间体结合的生长抑制剂(二价金属离子)，抑制剂达到一定浓度，抗生素低产菌株不能生长而高产菌株能够幸存下来，因而可能筛选到高产菌株。抗性的机制为形成大量产物或中间体和二价金属离子结合以解除二价金属离子对生产菌的毒性。但是用此方法，细胞膜透性降低而对二价金属离子具有抗性的菌株也会存留下来，需要进一步进行摇瓶筛选，通过抗生素产量的比较去除那些并不高产的抗性突变株。
　　采用上述方法筛选出青霉素和杆菌肽等抗生素的高产菌株。杆菌肽能和二价金属离子结合，具有输送二价金属离子进出细胞的生理功能。选育杆菌肽高产菌株时，于培养基中添加适量的硫酸亚铁，在此条件下筛选到的抗性菌株多数表现出高产的特性，其可能的抗性机理是：生产菌形成大量的杆菌肽和二价铁离子结合，将二价铁离子送出细胞外，从而避免了二价铁离子对生产菌的毒性作用。

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(g) 筛选前体或前体结构类似物抗性突变株。前体或前体结构类似物对某些抗生素产生菌的生长有抑制作用，且可抑制或促进抗生素的生物合成。筛选对前体或前体结构类似物的抗性突变株，可以消除前体结构类似物对生产菌的生长及其抗生素合成的抑制作用，提高抗生素产量。例如，灰黄霉素发酵使用氯化物为前体，筛选抗氯化物的突变株，提高了灰黄毒素的产量；以苯氧乙酸为青霉素前体，选用抗苯氧乙酸突变株，提高了青霉素V的发酵产量；以青霉素的前体缬氨酸、α-氨基己二酸或半胱氨酸、缬氨酸的结构类似物，筛选抗性菌株，提高了青霉素的发酵产量。
　　依据前体特性的不同，筛选抗性突变株的增产机理也有所不同。第一类前体是产生菌不能合成或很少合成的化合物，这一类前体通常需要人为地添加到发酵培养基中以促进提高抗生素产量或提高抗生素某一组分的产量。例如青霉素侧链前体苯氧乙酸、苯乙酸等，这一类前体通常对产生菌的生长具有毒性作用。对这些前体具有抗性的高产菌株可以通过高活性的酰基转移酶将前体掺入青霉素分子的侧链中，以合成青霉素，并解除前体对产生菌的毒性，使产生菌在高浓度的毒性前体存在时也能生长。筛选这一类前体的抗性突变株，应注意避免那些由于细胞膜透性下降使前体吸收减少的低产突变株或那些由于加强了对前体氧化分解的低产突变株。第二类前体是产生菌能够合成但不能大量积累的初级代谢中间产物，发酵生产中需要在发酵培养基中补充这一类前体以提高抗生素产量。例如红霉素发酵生产中添加丙醇以提高发酵产量。这一类物质过多会干扰产生菌的初级代谢而抑制菌的生长。抗性菌株的增产机理可能在于迅速将丙酸衍生物合成为红霉素，从而避免丙酸衍生物对初级代谢的干扰作用。第三类前体是初级代谢终产物，这一类前体一般对自身的抗生素合成有反馈调节作用，因而难以在细胞内大量积累。例如青霉素发酵生产中缬氨酸反馈抑制乙酰羟酸合成酶，从而抑制了缬氨酸的合成。筛选缬氨酸结构类似物抗性突变株，可使乙酰羟酸合成酶对缬氨酸的反馈抑制的敏感性减弱，促使细胞的内源缬氨酸的浓度增加而提高青霉素产量。

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(h) 筛选自身所产的抗生素抗性突变株。某些抗生素产生菌的不同生产能力的菌株，对其自身所产的抗生素的耐受能力不同，高产菌株的耐受能力大于低产菌株。因此，可用自产的抗生素来筛选高产菌株。例如有人把金霉素产生菌多次移种到金霉素浓度不断提高的培养基中去，最后获得一株提高生产能力4倍的突变株。此方法在抗生素高产菌株选育中有广泛应用，青霉素、链霉素、庆大霉素等抗生素的产生菌均有用此方法来提高产量的例子。此方法还适用于进一步纯化高产菌株。
　　用于菌种理性化筛选的还有各种类型的突变株，如组成型突变株、消除无益组分的突变株、能有效利用廉价碳源或氮源的突变株、细胞形态改变更有利于分离提取工艺的突变株、抗噬菌体的突变株等等。这些突变株均有重大的经济价值，而且这些筛选目标虽然不以产量为惟一目标，但突变株所具有的优良特性却往往能导致产量的提高。例如红霉素生产中的抗噬菌体菌种，其红霉素产量表现出较大的变异范围，得到比原种产量高的突变株。这可能是由于发生了抗噬菌体突变后，动摇了菌种原有的遗传基础，使之更容易获得高产突变株。

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㈤ 突变基因的表现
　　菌种的发酵产量决定于菌种的遗传特性和菌种的培养条件。突变株的遗传特性改变了，其培养条件也应该作出相应的改变。在菌种选育过程的每个阶段，都需不断改进培养基和培养条件，以鉴别带有新特点的突变株，寻找符合生产上某些特殊要求的菌株。高产菌株被筛选出来以后，要进行最佳发酵条件的研究，使高产基因能在生产规模上得以表达。例如，诱变处理四环素产生菌得到的突变株，在原培养基上与出发菌株相比较，发酵单位的提高并不明显，但是在原培养基配方中增加碳、氮浓度，调整磷的浓度，该菌株就表现出代谢速度快、发酵产量高的特性。用该菌株进行生产，并采用通氨补料的工艺来适应该突变株代谢速度快的特点，使产量有了新的突破。

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第四节　生产菌种的改良

　　采用合适的筛选方法，诱变育种可以获得高产菌株。但不能达到定向育种的目的。随着现代生物技术的发展，常规的杂交育种，原生质体融合，DNA重组可达到改良菌种的目的。
　　杂交育种一般指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。真菌、放线菌和细菌均可进行杂交育种。杂交育种是选用已知性状的供体菌株和受体菌株作为亲本，把不同菌株的优良性状集中于组合体中。因此，杂交育种具有定向育种的性质。杂交后的杂种不仅能克服原有菌种生活力衰退的趋势，而且，杂交使得遗传物质重新组合，动摇了菌种的遗传基础，使得菌种对诱变剂更为敏感。因此，杂交育种可以消除某一菌种经长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象。通过杂交还可以改变产品质量和产量，甚至形成新的品种。总之，杂交育种是一种重要的育种手段。但是，由于操作方法较复杂、技术条件要求较高，其推广和应用受到一定程度的限制。杂交育种主要有常规的杂交育种和原生质体融合这两种方法，近年来，后一种方法较为多见。

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常规的杂交育种

　　常规的杂交育种不需用脱壁酶处理，就能使细胞接合而发生遗传物质重新组合。现以青霉菌的杂交育种为例，说明杂交的主要过程。青霉菌的杂交过程实际上也是青霉菌准性生殖的过程，见图4-8所示。

图4-8　霉菌的准性生殖