[推荐]微生物与发酵工艺知识大全

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⒉ 空气过滤除菌的介质
　　用于空气过滤的过滤介质有纤维状物或颗粒状物、过滤纸、微孔滤膜等各种类型。
　　⑴ 纸类过滤介质　玻璃纤维纸属于深层过滤技术。一般应用时需将3～6张滤纸叠在一起使用，这类过滤介质的过滤效率相当高，对于大于0.3 μm的颗粒的去除率为99.99％以上，同时阻力也比较小，压降较小。其缺点是强度不大，特别是受潮后强度更差。为了增加强度，在纸浆中加入7％～50％的木浆。玻璃纤维纸很薄，纤维间的孔隙约为1～1.5 μm，厚度约为0.25～0.4 mm，密度为2600 kg／m3，堆积密度为384 kg／m3，填充率为14.8％。
　　⑵ 纤维状或颗粒状过滤介质
　　① 棉花。常用的过滤介质，通常使用的是脱脂棉，它的特点是有弹性，纤维长度适中。使用时一般填充密度是130～150 kg／m3，填充率为8.5％～10％。
　　② 玻璃纤维。其优点是纤维直径小，不易折断，过滤效果好。纤维直径约为5～19 μm，填充密度为130～280 kg／m3，填充率为5％～11％。
　　③ 活性炭。要求活性炭质地坚硬，不易压碎，颗粒均匀，装填前应将粉末和细粒筛去。常用小圆柱体的颗粒活性炭，大小为(ф3×10) ～(ф3×15) mm，密度1140 kg／m3，填充密度为470～530 kg／m3，填充率为44％。
　　实际应用过程中通过过滤介质的气流速度一般为0.2～0.5 m／s，压力降为0.01～0.05 MPa。纤维状或颗粒状过滤介质过滤除菌靠惯性、拦截、布朗运动、静电吸引等作用。对0.3 μm以下的颗粒的过滤效率仅为99％，难以满足发酵工业的无菌要求，需要多次过滤。该类过滤介质的缺点是体积大，占有空间大，操作困难，装填介质费时费力，介质装填的松紧程度不易掌握，空气压降大，介质灭菌和吹干耗用大量蒸汽和空气。
　　⑶ 微孔滤膜类过滤介质　微孔滤膜类过滤介质的空隙小于0.5 μm，甚至小于0.1 μm，能将空气中的细菌真正滤去，即绝对过滤，它的特点是易于控制过滤后的空气质量，节约能量和时间，操作简便。微孔滤膜类过滤介质对空气中的细菌和尘埃有滤除作用外，还有静电作用。通常在空气过滤之前应将空气中的油、水除去，以提高此类过滤介质的过滤效率和使用寿命。

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⒊ 提高过滤除菌效率的措施
　　鉴于目前所采用的过滤介质均需在干燥条件下才能进行除菌，因此需要围绕介质来提高除菌效率。提高除菌效率的主要措施如下。
　　① 设计合理的空气预处理设备，选择合适的空气净化流程，以达到除油、水和杂质的目的。
　　② 设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质。
　　③ 保证进口空气清洁度，减少进口空气的含菌数。方法有：加强生产场地的卫生管理，减少生产环境空气中的含菌数；正确选择进风口，压缩空气站应设上风向；提高进口空气的采气位置，减少菌数和尘埃数（吸气口每升高3.05 m，空气中微生物数就下降一个数量级，吸气口一般距地面5～10 m为好）；加强空气压缩前的预处理。
　　④ 降低进入空气过滤器的空气相对湿度，保证过滤介质能在干燥状态下工作。其方法有：使用无油润滑的空气压缩机；加强空气冷却和去油去水；提高进入过滤器的空气温度，降低其相对湿度。

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第六章　生物反应动力学

　　生物反应动力学研究生物反应的规律。生物反应基本上有两种情况：一种是使底物在酶(游离酶或固定化酶)的作用下进行反应，如淀粉的液化、异构糖的生产、无侧链青霉素(6-APA)的制造等；另一种是通过细胞的培养，利用细胞中的酶系，把培养基中的物质通过复杂的生物反应转化成新的细胞及其代谢产物。本章主要讨论是后一种情况，即微生物发酵生产过程中菌体生长、基质消耗、产物生成的动态平衡及其内在规律，具体内容有微生物生长过程中质量的平衡、发酵过程中菌体的生长速率、基质消耗速率和产物生成速率的相互关系、环境因素对三者的影响以及影响反应速率的因素。
　　通过对生物反应动力学的研究，进行最佳发酵生产工艺条件的控制。发酵过程中，菌体的浓度、基质浓度、温度、pH值、溶解氧等工艺参数的控制方案，也可在这研究的基础上进行优选。另外设计合理的发酵过程，也必须以发酵动力学模型作为依据，利用计算机进行程序设计、模拟最合适的工艺流程和发酵工艺参数，从而使生产控制达到最优化。发酵动力学的研究还在为试验工厂比拟放大，为分批发酵过渡到连续发酵提供理论依据。

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第一节　生物反应过程动力学描述 菌体生长速率

　　微生物进行发酵过程反应系统的动力学描述常采用群体来表示。微生物群体的生长速率反映群体生物量的生长速率。因此，菌体量的生长概念是生产速率的核心。菌体量一般指其干重，在液体培养基中的群体生长，其生长速率通常用单位体积来表示，指单位体积、单位时间里生长的菌体量；在表面上的群体生长，其生长速率应以单位表面积来表示，生长的微生物群体存在着细胞大小的分布。由于单细胞的生长速率与细胞的大小直接相关，因此也存在生长速率分布。下面所讨论的微生物生长速率是指具有这种分布的群体平均值。群体的繁殖速率是群体的各个新单体的生长速率。
　　菌体比生长速率是菌体浓度除菌体的生长速率或菌体浓度除菌体的繁殖速率。在平衡条件下，菌体比生长速率μ的定义式为：

式中　t——时间，h；
c(X)——菌体浓度，g／L；
μ——菌体比生长速率，h-1；
vx——菌体生长速率，g／(L·h)。
　　菌体生长速率vx与微生物的浓度c(X)成正比。菌体比生长速率μ除受细胞自身遗传信息支配外，还受环境因素的影响。

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基质消耗速率

　　以菌体得率系数为媒介，可确定基质（或称底物）的消耗速率与生长速率的关系。基质的消耗速率vs可表示为：

式中　c(S)——基质浓度，mol／L；
vs——基质的消耗速率，mol／(L·h)；
Yx／s——菌体得率系数，g／mol。
基质的消耗速率如果以单位菌体表示，称为基质的比消耗速率，以v表示：

式中　v——基质的比消耗速率，mol／(g·h)

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代谢产物的生成速率

　　由微生物反应生成的代谢产物种类很多，并且微生物细胞内的生物合成途径与代谢调节机制各有特色，因此很难用统一的生成速率模式来表示。代谢产物有分泌于培养液中的，也有保留在细胞内的，因此讨论生成速率的数学模型有必要区分这两种情况。
与生长速率和底物消耗速率相同，当以体积为基准时，称为代谢产物的生成速率，记为vP；当以单位质量为基准时，称为产物的比生成速率，记为QP，相关式为：

式中　　c(P)——产物浓度，g／L；
QP——产物比生成速率，h-1；
vP——产物生成速率，g／(L·h)。

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第二节　生物反应模式与发酵方法
　　为了获得生物反应过程变化的第一手资料，首先，要尽可能寻找能反映过程变化的理化参数；其次，将各种参数变化和现象与发酵代谢规律联系起来，找出它们之间的相互关系和变化；第三，建立各种数学模型以描述各参数随时间变化的关系；第四，通过计算机的在线控制，反复验证各种模型的可行性与适用范围。 一 生物反应动力学分类

　　现将各种发酵动力学分类列于表6-1。
表6-1　发酵动力学分类

　　⒈ 根据细胞生长与产物形成是否偶联进行分类
　　Luedeking-Piret模型是一常见的分批发酵产物合成动力学模型，它把产物生成速率看作是菌体生长速率和菌体浓度的函数，用数学式表示为：

式中　α——与生长偶联的产物形成系数，g／g细胞；
β——非生长偶联的比生产速率，g／(g细胞·h)。
根据细胞生长与产物形成是否偶联分为三种类型，见图6-1。

图6-1　分批发酵中微生物细胞的生长与产物形成的动力学模型
　　⑴ 偶联型　产物生成速率与细胞生长速率有紧密联系，合成的产物通常是分解代谢的直接产物，如葡萄糖厌氧发酵生成乙醇，或者好气发酵生成中间代谢物(氨基酸或维生素)。这类初级代谢产物的生产速率与生长直接有关。如下式：

式中　α>0，β＝0
　　⑵ 非生长偶联型　在生长和产物无关联的发酵模式中，细胞生长时，无产物，但细胞停止生长后，则有大量产物积累，产物的形成速率只与细胞积累量有关。产物合成发生在细胞生长停止之后(即产生于次级生长)，故习惯上把这类与生长无关联的产物称为次级代谢产物，但不是所有次级代谢产物一定是与生长无关联的。大多数抗生素和微生物毒素的发酵都是非生长偶联的例子，非偶联型发酵的生产速率只与已有的菌体量有关，而比生产速率β为一常数，与比生长速率μ没有直接关系。因此，其产率和产物浓度高低取决于细胞生长期结束时的生物量。产物形成与细胞浓度关系如下：

式中　α＝0，β>0
　　⑶ 混合型　生长与产物生成相关(如乳酸、柠檬酸、谷氨酸等的发酵)，发酵产物生成速率可由Luedeking-Piret模型数学式描述，式中　α>0，β>0。
该混合型模型复杂的形成是将常数α、β作为变数，它们在分批发酵的四个时期分别具有特定的数值。

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⒉ 根据产物生成与基质消耗的关系分类
　　按照菌体生长、碳源的利用以及产物的生成速度的变化以及这三者之间的动力学关系来考虑，Gaden把微生物发酵过程分为三种类型，见图6-2。

类型Ⅰ　　　　　　　　　　类型Ⅱ　　　　　　　　类型Ⅲ
图6-2　按Gaden分的发酵类型

　　⑴ 类型Ⅰ　产物的生成直接与基质(糖类)的消耗有关，这是一种产物合成与利用糖类有化学计量关系的发酵（如酒精发酵C6H12O6→2C2H5OH+2CO2），糖提供了生长所需的能量。糖耗速度与产物合成速度的变化是平行的，如利用酵母菌的酒精发酵和酵母菌的好气生长。在厌氧条件下，酵母菌生长和产物合成是平行的过程；在通气条件下培养酵母时，底物消耗的速度和菌体细胞合成的速度是平行的。这种形式也叫做有生长联系的培养。
　　⑵ 类型Ⅱ　产物的生成间接与基质(糖类)的消耗有关，例如柠檬酸、谷氨酸发酵等。即微生物生长和产物合成是分开的，糖既满足细胞生长所需能量，又充作产物合成的碳源。但在发酵过程中有两个时期对糖的利用最为迅速，一个是最高生长时期，另一个是产物合成最高的时期。如在用黑曲霉生产柠檬酸的过程中，发酵早期糖被用于满足菌体生长，直到其他营养成分耗尽为止，然后代谢进入使柠檬酸积累的阶段，产物积累的数量与利用糖的数量有关，这一过程仅得到少量的能量。
　　⑶ 类型Ⅲ　产物的生成显然与基质(糖类)的消耗无关，例如青霉素、链霉素等抗生素发酵。即产物是微生物的次级代谢产物，其特征是产物合成与利用碳源无准量关系，产物合成在菌体生长停止才开始。此种培养类型也叫做无生长联系的培养。

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二 发酵方法
　　微生物发酵过程根据发酵条件要求分为好氧发酵和厌氧发酵。好氧发酵法有液体表面培养发酵、在多孔或颗粒状固体培养基表面上发酵和通氧深层发酵几种方法。厌氧发酵采用不通氧的深层发酵。因此，无论好氧与厌氧发酵都可以通过深层培养来实现，这种培养均在具有一定径高比的圆柱形发酵罐内完成，就其操作方法可分为以下几种。
　　⑴ 分批式操作　底物一次装入罐内，在适宜条件下接种进行反应，经过一定时间后，将全部反应物取出。
　　⑵ 半分批式操作　也称流加式操作。是指先将一定量底物装入罐内，在适宜条件下接种使反应开始。反应过程中，将特定的限制性底物送入反应器，以控制罐内限制性底物浓度在一定范围，反应终止将全部反应物取出。
　　⑶ 反复分批式操作　分批操作完成后取出部分反应系，剩余部分重新加入底物，再按分批式操作进行。
　　⑷ 反复半分批式操作　流加操作完成后，取出部分反应系，剩余部分重新加入一定量底物，再按流加式操作进行。
　　⑸ 连续式操作　反应开始后，一方面把底物连续地供给到反应器中，同时又把反应液连续不断地取出，使反应过程处于稳定状态，反应条件不随时间变化。
　　㈠ 分批发酵法(batch fermentation)
　　分批发酵又称分批培养，发酵工业中常见的分批发酵方法是采用单罐深层分批发酵法。每一个分批发酵过程都经历接种、生长繁殖、菌体衰老进而结束发酵，最终提取出产物。这一过程在某些培养液的条件支配下，微生物经历着由生到死的一系列变化阶段，在各个变化的进程中都受到菌体本身特性的制约，也受周围环境的影响。只有正确认识和掌握这一系列变化过程，才有利于控制发酵生产。
　　分批发酵的特点是：微生物所处的环境是不断变化的，可进行少量多品种的发酵生产，发生杂菌污染能够很容易终止操作，当运转条件发生变化或需要生产新产品时，易改变发酵对策，对原料组成要求较粗放等。
　　分批培养过程微生物生长可分为：停滞（或调整）期、对数（生长）期、稳定期和衰亡期四个阶段。研究细胞的代谢和遗传宜采用生长最旺盛的对数期细胞。在发酵工业生产中，使用的种子应处于对数期，把它们接种到发酵罐新鲜培养基时，几乎不出现停滞期，这样可在短时间内获得大量生长旺盛的菌体，有利于缩短生产周期。在研究和生产中，常需延长细胞对数生长阶段。
　　㈡ 补料分批发酵法(fed-batch fermentation)
　　补料分批发酵又称半连续发酵或半连续培养，是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法。与传统分批发酵相比，其优点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度。低基质浓度的优点为：① 可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不致加剧供氧的矛盾；② 避免培养基积累有毒代谢物。
　　补料分批发酵广泛应用于抗生素、氨基酸、酶制剂、核苷酸、有机酸及高聚物等的生产。
　　㈢ 连续发酵法(continuous fermentation)
　　连续发酵又称连续培养，连续发酵过程是当微生物培养到对数期时，在发酵罐中一方面以一定速度连续不断地流加新鲜液体培养基，另一方面又以同样的速度连续不断地将发酵液排出，使发酵罐中微生物的生长和代谢活动始终保持旺盛的稳定状态，而pH值、温度、营养成分的浓度、溶解氧等都保持一定，并从系统外部予以调整，使菌体维持在恒定生长速度下进行连续生长和发酵，这样就大大提高了发酵的生长效率和设备利用率。连续发酵优缺点见表6-2。
表6-2　连续发酵的优缺点

连续发酵有多种类型，如表6-3所示。
表6-3　连续发酵类型

现分别介绍开放式和封闭式连续发酵系统。

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⒈ 开放式连续发酵
　　在开放式连续发酵系统中，培养系统中的微生物细胞随着发酵液的流出而一起流出，细胞流出速度等于新细胞生成速度。因此在这种情况下，可使细胞浓度处于某种稳定状态。另外，最后流出的发酵液如部分返回(反馈)发酵罐进行重复使用，则该装置叫做循环系统，发酵液不重复使用的装置叫做不循环系统。
　　⒉ 封闭式连续发酵
　　在封闭式连续发酵系统中，运用某种方法使细胞一直保持在生物反应器内，并使其数量不断增加。这种条件下，某些限制因素在生物反应器中发生变化，最后大部分细胞死亡。因此在这种系统中，不可能维持稳定状态。封闭式连续发酵可以用开放式连续发酵设备加以改装，只要使用部分菌体重新循环。另一种方法是采用间隔物或填充物置于设备内，使菌体在上面生长，发酵液流出时不带细胞或所带细胞极少。连续发酵类型见表6-3。
　　透析膜连续发酵是一个新方法，它是采用一种具有微孔的有机膜将发酵设备分隔，这种膜只能通过发酵产物，而不能通过菌体细胞。这样，将培养液连续流加到发酵设备的具有菌体的间隔中，微生物的代谢产物就通过透析膜连续不断地从另一间隔流出。在一些发酵过程中，当发酵液中代谢产物积累到一定程度时就会抑制它的继续积累，而采用透析膜发酵的方法可使代谢产物不断透析出去，发酵液中留下不多，因而可以提高产物得率。